Nyitókép: a Botrytis cinerea

A Botrytis nemzetség tagjait betegségeket okozó mikroorganizmusokként tartjuk nyilván. A növények olyan fontos csoportjait veszélyeztetik, mint a szántóföldi és üvegházi kultúrák, bogyós gyümölcsök, szőlő, dísznövények és facsemeték. Ezen kívül sok egyéb növényben és kultúrában is jelentős károkat tudnak okozni, amelyek azonban kisebb gazdasági jelentőségük miatt nem kerülnek a figyelem középpontjába. Emellett tárolási betegséget okozó mikroorganizmusokként is jelentősek, mivel hidegtűrő képességük miatt jelentős károkat okozhatnak a termékek raktározása és szállítása során.

A Botrytis nemzetségbe tartozó Botrytis cinerea bizonyítottan 235 gazdanövényt képes megtámadni, és rajtuk a szürkerothadás nevű megbetegedést kiváltani (Jarvis, 1977). A Botrytis cinerea két rejtett fajt foglal magába: I. csoport (B. pseudocinerea) és II. csoport (B. cinerea sensustricto). Az I. és a II. csoportba tartozó botritiszek mind fertőzőképességükben, mind genetikai sokféleségükben, mind fungicidekkel szembeni érzékenységükben különböznek egymástól. Következésképpen a megfelelő védekezési stratégia megválasztásának érdekében a gomba rejtett fajainak azonosítása, és azok ökológiai specializációjának meghatározása elengedhetetlen.

A két testvérfajt azonban nem lehet klasszikus (morfológiai, patogenitási, fiziológiai) rendszertani kritériumok alapján megkülönbözteti, ezért elkülönítésük kizárólag molekuláris módszerrel történik, mely több marker vizsgálatán alapszik. A DNS vizsgálatán alapuló technikák némelyike rendkívül időigényes. Vannak azonban köztük egyszerűbb vizsgálatok, melyek a két faj között eltérést mutató, úgynevezett polimorf DNS-szakaszok nukleotid sorrendjének különbségét jelenítik meg. Ilyen, a két csoport szétválasztására alkalmas változatos szekvenciák találhatók a következő B. cinerea génekben: Bc-hch, béta-ubulin és aox. Ahmed és Hamada (2005) a Bc-hch gén PCR-RFLP analízise segítségével különítették el az I. és II. csoportba tartozó B. cinerea izolátumokat.

Szürkerothadás

A vizsgálat első lépéseként a gomba Bc-hch génjét polimeráz láncreakció (PCR – Polymerase Chain Reaction) technika segítségével megsokszorozzák. A PCR-technika a molekuláris biológiai vizsgálatok alapja, „molekuláris fénymásolóként” szokták emlegetni. Nem más, mint in vitro (szó szerint: üvegben, kémcsőben, vagyis sejten kívül, mesterséges körülmények között) történő DNS-szintézis, mellyel egy kiválasztott DNS-szakaszt lehet felszaporítani. Alkalmazásával tehát egy vizsgálni kívánt DNS-szakasz nagy mennyiségben állítható elő.

A felszaporított DNS-szakaszt ezután speciális enzimmel, úgynevezett restrikciós endonukleázzal hasítják. Ezek az enzimek csak akkor hasítanak, ha egy adott szekvencia (4-6 nukleotidból álló felismerőhely) jelen van a DNS-ben. Több száz féle hasítóhelyet felismerő restrikciós endonukleáz enzimet ismerünk, melyek segítségével vizsgálhatjuk tehát a különböző eredetű DNS-szekvenciák közötti különbségeket. A B. cinerea két rejtett faja közti különbséget könnyen meg tudjuk jeleníteni a PCR-ral felszaporított Bc-hch gén HhaI nevű restrikciós endonukleázzal történő emésztése után kapott mintázat, vagyis a DNS fragmentek száma és azok nagysága alapján. (1. és 2. ábra). A B. cinerea sensu stricto (II-es csoport) esetén ugyanis 5, míg a B. pseudocinerea (I-es csoport) esetén 4 restrikciós hasító helye van az enzimnek az adott DNS-szakaszon belül. Ennek oka egy pontmutáció az I-es csoport Bc-hch génjében. A mutáció az enzim egyik felismerési helyét változtatja meg, következésképpen ott az enzim nem képes hasítani a DNS-t.

A sejtosztódásban szerepet játszó béta-tubulint kódoló gén egy konzervatív, minden eukarióta szervezetben megtalálható lokusz, melyet széles körben alkalmaznak a gombák filogenetikai vizsgálatára. Fournier és munkatársai 2005-ben számoltak be arról, hogy a béta-tubulin gén szekvenciájának egy részletét elemezve a két csoport elkülöníthető egymástól, és az eredmények jól korrelálnak a Bc-hch gén PCR-RFLP vizsgálata során kapottakkal. A későbbiekben számos helyen, többek között Magyarországon is alkalmazták ezt a módszert (Váczy és mtsai. 2008; Fekete és mtsai. 2012).

Nemrégiben kutatócsoportunk a Botrytis cinerea alternatív cianid rezisztens oxidázát (aox) vizsgálva jelentős különbségeket fedezett fel a két csoport aox génjének szekvenciája között (Szojka és Sándor, 2014a). Az aox génről képződő altrenatív oxidáz enzim (AOX) az úgynevezett alternatív légzést segíti elő, és ezáltal fontos szerepet kap a mikroszervezetek energiatermelő és bioszintetizáló rendszerének működésében. Az AOX nem gátolható nitrogén-oxiddal, aziddal, szulfiddal vagy cianiddal, melyek a citokróm oxidáz által katalizált sejtlégzés erős inhibitorai (Azcón-Bieto és mtsai. 1989; Huang és mtsai. 2002).

Tokaj Kikelet, aszú

Mindkét, előbb említett gén (béta-tubulin, illetve aox) esetében a vizsgálni kívánt DNS szakaszokat PCR-technika segítségével nagy mennyiségben felszaporítják, majd meghatározzák a képződő PCR-termékek nukleotid sorrendjét. A szekvenciákat azután bioinformatikai programok segítségével (pl. Clustal-X, GeneDoc) analizálva meghatározhatóak a fajcsoport fajai között található nukleotid eltérések (szekvencia különbségek).

Nem mindegy a védekezés

Annak ellenére, hogy az I. és II. csoportra jellemző eltéréseket szőlőről származó botritisz izolátumokban figyelték meg először (Giraud és mtsai. 1997) Franciaország Champagne régiójában, majd később szintén Franciaországban szőlőről és borsóról gyűjtöttek be Botrytis pseudocinerea törzseket (Fournier és mtsai. 2002), Magyarországon eddig nem sikerült I. csoportbeli botritiszt izolálni szőlőről. 

Egyes gazdanövények esetén a két faj együtt van jelen, bár a B. pseudocinerea jóval kisebb arányban fordul elő (Sándor 2013). Ahogyan egy korábbi közleményünkben olvasható volt (Szojka és Sándor 2014b), a szőlőszemek nemes rothadását (aszúsodását) mindkét faj (I. és II. csoport) képes előidézni, addig a botritisz elleni védekezés során korántsem elhanyagolható, hogy melyik ellen történik a küzdelem. A fajok fungicidekkel szembeni érzékenységében ugyanis markáns különbségek vannak. A B. pseudocinerea izolátumoknál gyakori a fenhexamid hatóanyaggal szembeni rezisztencia megléte. A B. cinerea sensu stricto esetében pedig azoxistrobinnal szembeni rezisztenciát említik (Asadollahi és mtsai. 2013). Mindezek alapján elmondható, hogy fontos a botritisz populációk folyamatos nyomon követése, melynek legegyszerűbb módja a fent említett DNS-alapú módszerek alkalmazása.

A cikk eredetileg a Tokaji Borvidék Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet kiadványában jelent meg (Szőlő-levél, IV. évfolyam, 7. szám). A szerzők a Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet munkatársai.

Irodalom:

Asadollahi M., Szojka A, Fekete E., Karaffa

L., Takács F., Flipphi M., Sándor E. 2013. Resistance to QoI Fungicide and

Cytochrome b Diversity in the Hungarian Botrytis cinerea Population. Journal of Agricultural Science and Technology, 15/2: 397-407.

Azcón-Bieto J., Ribas-Carbó M., González-Meler M., Peñuelas J. 1989. Sulfide resistant respiration in leaves of Elodea canadensis Michx: comparison with cyanide-resistant respiration. Plant Physiology. 90: 1249-1251.

Ben Ahmed D., Hamada W. 2005. Genetic diversity of some Tunisian Botrytis cinerea isolates using molecular markers. Phytopathologia Mediterranea. 44:300– 306.

Fekete É., Fekete E., Irinyi L., Karaffa L., Árnyasi M., Asadollahi M., Sándor E. 2012. Genetic diversity of a Botrytis cinerea cryptic species complex in Hunga-ry. Microbiological Research, 167: 283-291.

Fournier E., Giraud T., Brygoo Y. 2005. Partition of the Botrytis cinerea complex in France using multiple gene genealogies. Mycologia. 97: 1251–1267.

Fournier E., Giraud T., Loiseau A., Vautrin D., Estoup A., Solignac M., Cornuet J.M., Brygoo Y. 2002. Characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the fungus Botrytis cinerea (Ascomycota). Molecular Ecology Notes. 2: 253–255.

Giraud T., Fortini D., Levis C., Brygoo Y. 1997. RFLP markers show genetic recombination in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea) and transposable elements reveal two sympatric species. Molecular Biology and Evolution. 14: 1177–1185.

Huang X., von Rad U., Durner J. 2002. Nitric oxide induces transcriptional activation of the nitric oxide-tolerant alternative oxidase in Arabidopsis suspension cells. Planta. 215: 914-923.

Jarvis W. R. 1977. Botryotinia and Botrytis Species: Taxonomy, Physiology and Pathogenicity. Research Branch, Canada Department of Agriculture, Ottava, Canada

Sándor E. 2013. Botrytis cinerea a „Janus arcú” gomba. Szőlő-levél, III/9: 11-15.

Szojka A., Sándor E. 2014a. Az alternatív oxidáz, mint lehetséges marker a Botrytis cinerea filogenetikai vizsgálatában. Ag-rártudományi Közlemények (Acta Agraria Debreceniensis), 56: 127-132.

Szojka A., Sándor E. 2014b. Milyen szerepe lehet a kis RNS-eknek az aszúsodásban? Szőlő-levél, IV./5: 5-7.

Váczy K.Z., Sándor E., Karaffa L., Fekete E., Fekete É., Árnyasi M., Czeglédi L., Kövics G.J., Druzhinina I.S., Kubicek C.P. 2008. Sexual Recombination in the

Botrytis cinerea populations in Hungarian vineyards. Phytopathology, 98: 1312-1319.